了解一下腺苷酸环化酶的电镜酶细胞化学试验方法

　　下面让我们一起来了解一下腺苷酸环化酶的电镜酶细胞化学试验方法

　　腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。它也是一种磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'-环磷酸腺苷(cAMP)并释放出焦磷酸。

　　Howell等人(1972)首先用亚胺二磷酸腺苷(AMP-PNP)作底物，成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进行了定位。现已确认，在未固定和固定的组织中，ATP-PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物，在腺苷酸环化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应，生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性，为克服这一缺点， Fujiomto等(1981)设计了使用二钾亚砜(DMSO)的*法。下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的*法。

　　固定:配制固定液的缓冲液使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含8%蔗糖、5%的DMSO。

　　固定液配方: 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。对于肝脏来说，1%以上的戊二醛固定时，可导致明显的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能较好保存。总体来说，多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0~4℃固定2小时或室温固定1小时。

　　洗涤:用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时~过夜，期间更换缓冲液数次;而后进行厚切片;

　　孵育:配方及条件见\ref,

　　作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP-PNP在室温中或长期冷冻保存时，ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等化合物容易增多，应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP-PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性，在碱性磷酸酶活性高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂，应根据组织不同进行前处理后，将氟化钠加入到孵育液中。

　　后固定:后固定前，必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。

　　残存的DMSO可以与锇酸反应，产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1%~2%的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为固定时间不应超过10min，超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由于全部溶出而导致*没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2~4%的戊二醛代替锇酸进行后固定。

　　对照实验中可除去底物AMP-PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。